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    Fluorospark(R) 激酶/ADP 多重檢測試劑盒(291-77401)

    來源:作者:人氣:-發表時間:2020-09-02 15:50:00【
    Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit是和光(wako)與日本東京大學新藥研究機構共同研發的ADP熒光檢測試劑盒。擁有高通量篩選(HTS)必備的高靈敏度、高準確度、低成本、簡便等特性。本產品不僅可檢測激酶,同時可用于檢測產生ADP的酶(如ATP酶、乙酰基—CoA羧化酶)的活性。咨詢訂購熱線:400-021-8158
    激酶分析篩選試劑盒
    Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒(貨號291-77401)
    Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
    Fluorospark(R) 激酶/ADP多重檢測試劑盒(#291-77401)
    Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒
    簡單快捷,高靈敏度定量檢測ADP。用紅色熒光“Resorufin”定量經激酶反應生成的ADP,可實時檢測。
    • 激酶抑制劑的篩選
    • 激酶活性測定
    • ADP產生酶活性分析
    試劑盒原理
    本試劑盒通過酶偶聯反應,簡單、高靈敏度地定量檢測ADP。經激酶反應生成的ADP,可用紅色熒光物質試鹵靈定量。
    Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒檢測原理
    Fluorospark® 激酶/ADP多重檢測試劑盒檢測原理
    優點/特點
    ● 適合終點(endpoint)和實時實驗
    ● 優異的Z'-factor數據(數據差異小)
    ● 高靈敏度檢測ADP量
    ● 檢測直到ADP 30 μmol/L仍可保持線性關系
    ● 一步反應,檢測時間短(~30分鐘)
    ● 成本較低
    與傳統發光法比較
    試劑名稱
    Fluorospark® Kinase
    傳統發光法(A公司)
    原理
    ADP定量(熒光)
    (直接定量生成的ADP)
    ADP定量(發光)
    (需要把生成的ADP變換成ATP再定量)
    操作順序
    1步
    2步
    所需時間
    30分鐘
    70~100分鐘
    ADP定量范圍
    ~30 μmol/L
    ~1 mmol/L
    價格
    低成本
     
    試劑盒組成
    No. 試劑
    用途
    1,000
    10,000
    底物液
    2×制備檢測液
    9 mL
    90 mL
    酶液
    500 μL
    5 mL
    刃天青液
    100 μL
    1 mL
    還原封閉劑
    400 μL
    4 mL
    D 終止液
    停止偶聯反應
    10 mL
    100 mL
    10 mmol/L ATP溶液
    激酶反應,制作標準曲線
    100 μL
    1 mL
    10 mmol/L ADP溶液
    制作標準曲線
    100 μL
    1 mL
    案列應用
    【實驗流程(終點(endpoint)法)】

    激酶反應液里添加等量的2×檢測液(使用時制備)即可檢測激酶活性
    【制作ADP標準曲線】
    用0、10、20、30 μmol/L ADP制作標準曲線。

    良好的線性關系可定量最多至30 μmol/L的ADP。
    【低濃度ADP區域里定量】
    制作各ATP/ADP濃度(ATP+ADP=1,10,100 μmol/L)里底物變換率0-10%標準曲線
    低濃度ADP區域0-10%標準曲線
    ATP/ADP標準曲線里底物變換率低(=ADP濃度低)時線性關系依然較好
    【熒光信號的穩定性】
    20 μmol/L ADP和2x檢測液混合,在30分鐘~7小時候檢測熒光強度。30分鐘后的熒光強度標準化為100%,相關變動表格如下。
    添加2×檢測液之后的時間
    ADP和2×檢測液混合后,在30分~7小時內的熒光信號十分穩定。
    【數據:Z'-factor實測值】
    定量與各ATP/ADP濃度(ATP+ADP=1,10,100 μmol/L),5%底物變換率相當的ADP時,本試劑盒方法與傳統發光法的Z'-factor比較。
    Z'-factor實測值
    Z'-factor:Fluorospark® Kinase >傳統發光法(A公司)
    在各ATP濃度里,5%低底物變換率也有優異的Z'-factor。
    【什么是Z'-facotr】
    Z'-facotr是一個關于信號區間和變異的組合,它已成為評估測試方法質量的主要參數。使用Z'-factor=1-(3×SDH+3×SDL)/(AvH-AvL)公式計算(SDH和SDL為陽性對照和陰性對照的方差,AVH和AVL為陽性對照和陰性對照的平均值)。
     Z-factor
     Interpretation
     1.0
     理想情況下等于1.0。Z factor永遠不可能超過1.0。
     0.5-1.0之間
     較好的實驗。
     0-0.5之間
     臨界的實驗(較差的實驗)。
     小于0
     陽性對照和陰性對照的數值有很多重疊。
    【制作抑制曲線】
    制作cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)抑制劑H-89的抑制曲線 (PKA 0.02U/μL,ATP 5μmol/L,Kemptide 125μg/mL及各濃度的H-89)
    cAMP-依賴性蛋白激酶(PKA)抑制劑H-89的抑制曲線
    Fluorospark® Kinase與傳統發光法(A公司)有幾乎相同的IC50值。
    (本方法得到的H-89 IC50值與文獻值*(IC50=40nmol/L)幾乎相同)
    * Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).
    【實驗流程(實時法)】
    實驗流程(實時法)
    通過實時檢測熒光強度,實時檢測激酶活性。
    【ADP定量反應時間的比較(實時檢測)】
    對各濃度ADP[ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L(ATP+ADP=10 μmol/L)]進行實時檢測。
    ADP定量反應時間的比較
    Fluorospark® Kinase在約十分鐘內完成ADP定量反應。背景(ADP=0 μmol/L)信號穩定。
    【實時檢測添加DTT的影響】
    ADP=2 μmol/L(ATP+ADP=10 μmol/L)里添加還原劑DTT(0.1、1 mmol/L),進行實時檢測。
    實時檢測添加DTT的影響
    Fluorospark® Kinase在約十分鐘內完成ADP定量反應。即使DTT濃度增高,結果依然穩定。
    【通過實時檢測計算PKA的Km(ATP)值】
    在各種ATP濃度下通過實時檢測計算出PKA反應速度,并求取ATP的PKA(Km值)
    通過實時檢測計算PKA的Km(ATP)值
    根據實時檢測進行酶的動力學分析。
    本方法得到的Km值與文獻值**(3~15 μmol/L)幾乎相同)
    ** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).
    產品列表
    產品編號
    產品名稱
    規格
    級別
    291-77401
     
    Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
    Fluorospark® 激酶/ADP 多重檢測試劑盒
     
    1000次
    for Enzyme Activity Assay
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